鴨絨及鵝絨制品采用熒光PCR鑒定方法

　　1 引言

　　羽絨是指生長在鵝、鴨腹部呈蘆花朵狀的絨毛，是一種動物性蛋白質纖維，在羽絨、棉花、羊毛和蠶絲四大天然保暖材料中，羽絨的保暖性能最佳[1]。然而，目前市場上的羽絨制品價格高低懸殊，存在不少羽絨制品摻假造假現象[2-3]，現階段，羽絨市場存在用劣質原料冒充、標示的充絨量與實際不符、蓬松度不合格、清潔度不合格等問題[4]，其中常見的用劣質原料冒充的方式有：用腈綸棉制成的假羽絨制品、用原毛制作羽絨制品、用粉碎絨(飛絲)制作的羽絨制品[5]。

　　在檢測行業中，羽絨的鑒定主要依據國家標準GB/T 10288—2003《羽絨羽毛檢驗方法》及行業標準FZ/T 80001—2002《水洗羽毛羽絨試驗方法》提供的方法，該方法是通過光學顯微鏡，用肉眼觀察樣品的顯微結構，并對比標準中關于鴨絨、鵝絨及其它鳥類絨毛顯微特征的文字描述和圖示進行歸類鑒定。該方法對檢驗人員要求高、主觀性大，容易產生誤判，使用的示意圖和文字描述簡單，缺乏實物標樣參照，給實際檢驗工作帶來困難[6]。

　　有鑒于此，本研究開發了鴨絨及鵝絨制品的熒光PCR鑒定方法，以期與傳統鑒定方法相結合，提高羽絨鑒定的客觀性和準確度。

　　2 材料和方法

　　2.1 材料與試劑

　　2.1.1 試驗材料

　　試驗所用的鴨絨、鵝絨等制品來自市場購買。

　　2.1.2 試劑

　　異硫氰酸胍、聚乙烯基吡咯烷酮K-40(PVP K-40)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇為Amersco公司產品，鮭精DNA為Sigma公司產品，Taq酶及2×premix ExTaq酶購自寶生物工程(大連)有限公司，引物及探針(表1)由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

　　2.2 方法

　　2.2.1 DNA提取

　　挑取帶毛囊的羽絨，剪取毛囊部位約0.03g樣品，加入3mL 2% SDS溶液[2% SDS，50mmol/L Tris·Cl(pH值8.0)，20mmol/L EDTA(pH值8.0)]，65℃水浴1.5h，不時振蕩;12000r/min離心5min，取上清;加入3mL羊毛提取液[4mol/L異硫氰酸胍，0.3mol/L氯化鈉，4% PVPK-40，50mmol/L Tris·Cl(pH值8.0)，20mmol/L EDTA(pH值8.0)]及60μLβ-巰基乙醇，65℃水浴4.5h，不時振蕩;12000r/min離心5min，取上清，加入等體積酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，顛倒混勻，12000r/min離心10min;取上清，加入1μL 10mg/mL鮭精DNA，1/10體積的3mol/L乙酸鈉(pH值5.2)及等體積異丙醇，-20℃沉淀過夜，12000r/min離心15min收集沉淀;小心倒去上清，用70%乙醇洗滌二次，風干;取50μL去離子水溶解沉淀。

　　2.2.2 熒光PCR檢測體系建立

　　2.2.2.1 鴨絨、鵝絨特異性熒光引物設計

　　根據家鴨、番鴨、斑嘴鴨、家鵝、鴻雁、雞、家鴿、鵪鶉、北美火雞的線粒體12S rDNA全基因序列設計引物和探針，在考慮引物及探針特異性的基礎上，保證在引物和探針結合位點處，家鴨與其祖先種綠頭鴨及斑嘴鴨序列一致，家鵝與其祖先種鴻雁序列一致。

　　2.2.2.2 熒光PCR擴增及結果判斷

　　反應體系(20μL)：2×premix Ex Taq 10μL，上下游引物各0.2μmol/L，探針為0.1μmol/L，模板DNA為4μL。反應程序：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s，40個循環。結果判斷：Ct值≤35時，可判定結果為陽性;Ct值>35時，可判定結果為陰性。

　　2.2.2.3 方法特異性和檢出限試驗

　　以提取的家鴨、番鴨、鴨絨、鵝、鵝絨、雞、鵪鶉、家牛、水牛、豬、綿羊、山羊、馬、兔、小白鼠、鮭精DNA為擴增模板，使用鴨絨、鵝絨特異性引物和探針進行熒光PCR反應，以驗證方法的特異性;并以100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg的模板進行熒光PCR反應，以檢測方法的檢出限，每個梯度做三個平行。

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　　2.2.3 樣品檢測

　　選取18個鴨絨制品，按1.2.1的步驟提取DNA，按2.2.2進行熒光PCR反應，所使用的樣品見表2。由于鵝絨制品較稀少，在市面上購買不到鵝絨制品，樣品試驗中不包含鵝絨制品。

　　3 結果

　　3.1 鴨絨及鵝絨制品DNA提取方法的建立由于鴨絨及鵝絨制品含肉眼可見明顯毛囊，試驗中剪取鴨絨及鵝絨毛囊部位，使用SDS-異硫氰酸胍-β-疏基乙醇法[7]提取鴨絨及鵝絨DNA。所提取的DNA濃度達20ng～200ng，進行熒光PCR反應時鴨絨DNA及鵝絨DNA的Ct值分別為25和26(圖1)，表明使用該方法提取的DNA質量滿足熒光PCR要求。

　　3.2 方法特異性試驗結果

　　結果，鴨絨特異性熒光引物僅能擴增家鴨、番鴨及鴨絨DNA，與其它物種DNA無非特異性擴增;鵝絨特異性熒光引物僅能擴增家鵝及鵝絨DNA，與其它物種DNA無非特異性擴增，表明所設計的引物特異性好。

　　3.3 方法檢出限試驗結果

　　結果，使用本方法提取100%鴨絨原料及100%鵝絨原料DNA進行熒光PCR反應時DNA檢出限為10ng(含鮭精DNA)。

　　3.4 樣品檢測試驗結果

　　檢測結果表明18個鴨絨樣品均可檢出鴨DNA成分，未檢出鵝DNA成分，檢測結果與產品的明示成分一致(表1)。單獨使用家鴨特異性引物及番鴨特異性引物進行熒光PCR反應，18個樣品均檢出家鴨DNA成分，未檢出番鴨DNA成分，表明18個鴨絨制品均來自家鴨絨。

　　4 討論

　　動物纖維中的DNA主要存在于毛囊部位，在毛干中也存有少量線粒體DNA[8]，由于羽絨制品含有肉眼可見的毛囊，試驗過程中重點挑取毛囊部位，使用SDS-異硫氫酸胍-β-巰基乙醇DNA提取法[7]進行DNA提取時，羽絨毛囊部位基本溶解，毛干產生大范圍斷裂，通過樣品檢測試驗，表明該方法可成功提取鴨絨及鵝絨DNA。

　　本試驗選取線粒體16S rDNA基因序列作為引物設計靶位點，引物設計時，必須考慮所設計的引物可涵蓋全世界不同鴨鵝品系。理論上，由于鴨、鵝與其祖先種的分化時間久于鴨、鵝各品系分化時間，只要某段DNA序列在鴨鵝及其祖先種中保守，則可保證在所有的馴化品系中保守，從而在理論上保證該引物可檢測所有鴨鵝品系的羽絨制品。根據維基百科和相關文獻的報道[9-10]，除疣鼻棲鴨(Cairina moschata，俗稱番鴨)外，家鴨起源于河鴨屬中的綠頭野鴨(Anas Platyrhynchos)和斑嘴鴨(A. poecilorhyncha)，而番鴨是由中南美洲引入的鴨種。家鵝是由雁類野鳥經人類長期馴化形成，其中中國

　　家鵝由鴻雁(Anser cygnoides)馴化而成，歐洲家鵝由灰雁(A.anser)馴化而成。因而，下載家鴨、番鴨、家鵝與其祖先種，同時下載相近品種進行引物設計，所設計的引物通過NCBI數據庫BLAST比對以及特異性試驗，表明特異性好。

　　羽絨纖維種類的鑒定目前主要依靠顯微鏡法，該方法操作簡單，但過分依賴試驗人員的素質和經驗，主觀性過強，本研究開發的方法可作為傳統顯微鏡鑒定方法的有力輔助，進一步提高羽絨鑒定的客觀性和準確性。