アヒル絨毯及びガチョウ絨毯製品の蛍光PCR鑑定方法の採用

　　1はじめに

　　ダウンガチョウ、アヒルの腹部に生えた蘆の花狀の綿毛を指し、羽毛、綿、羊毛、シルクの4大天然保溫材の中で羽毛の保溫性能が最も優(yōu)れている動(dòng)物性タンパク質(zhì)繊維である[1]。しかし、現(xiàn)在市場における羽毛製品の価格は高低差が大きく、多くの羽毛製品に偽物が混入している[2-3]。現(xiàn)段階では、羽毛市場には劣悪な原料を用いて偽ったり、表示されているダウン充填量が実際と合わなかったり、ふわふわ度が不合格だったり、清潔度が不合格だったりする問題がある[4]。その中でよく見られる劣悪な原料を用いた偽った方法は、アクリル綿から作られた偽の羽毛製品、原毛を用いたダウン製品、粉砕ダウン（フライフィラメント）を用いたダウン製品[5]。

検査業(yè)界において、羽毛の鑑定は主に國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10288-2003「羽毛羽毛検査方法」及び業(yè)界標(biāo)準(zhǔn)FZ/T 80001-2002「水洗い羽毛試験方法」に基づいて提供された方法であり、この方法は光學(xué)顕微鏡を通じて、肉眼でサンプルの顕微鏡構(gòu)造を観察し、そして比較標(biāo)準(zhǔn)における羽毛、ガチョウの綿毛や他の鳥の綿毛の微細(xì)な特徴の文字記述と図示を分類して鑑定した。この方法は検査員に対する要求が高く、主観性が大きく、誤審が生じやすく、使用する見取り図と文字の記述が簡単で、実物標(biāo)本參照が不足し、実際の検査作業(yè)に困難をもたらした[6]。

そこで、本研究はアヒルの綿毛及びビロード製品の蛍光PCR鑑定方法を用いて、伝統(tǒng)的な鑑定方法と結(jié)合し、羽毛鑑定の客観性と精度を高めることを期待している。

　　2材料と方法

2.1材料と試薬

2.1.1試験材料

試験に用いたアヒルの綿毛、ガチョウの綿毛などの製品は市場から購入した。

2.1.2試薬

イソチオシアネート、ポリビニルピロリドンK-40（PVP K-40）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、β-メルカプトエタノールはAmersco社製品、サケ精DNAはSigma社製品、Taq酵素及び2×premexExTaq酵素は寶生物工學(xué)（大連）有限公司から購入し、プライマー及びプローブ（表1）は上海生工生物工學(xué)技術(shù)サービス有限公司から合成した。

2.2方法

2.2.1 DNA抽出

毛包付き羽毛を採取し、毛包部位約0.03 gのサンプルを切り取り、3 mL 2%SDS溶液[2%SDS、50 mmol/L Tris?Cl（pH値8.0）、20 mmol/L EDTA（pH値8.0）]、65℃水浴1.5 hを加え、時(shí)々振動(dòng)した、12000 r/min遠(yuǎn)心分離5 min、上清を取る、3 mL羊毛抽出液[4 mol/Lイソチオシアン酸グアニジン、0.3 mol/L塩化ナトリウム、4%PVPK-40、50 mmol/L Tris?Cl（pH値8.0）、20 mmol/L EDTA（pH値8.0）]及び60μLβ-メルカプトエタノールを加え、65℃水浴4.5 h、時(shí)々振動(dòng)した、12000 r/min遠(yuǎn)心5 min、上清を採取し、等體積フェノールを添加する：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）、逆さまに混合し、12000 r/min遠(yuǎn)心10 min、上清を採取し、1μL 10 mg/mL鮭精DNA、1/10體積の3 mol/L酢酸ナトリウム（pH値5.2）及び等體積イソプロパノールを添加し、?20℃で一晩沈殿し、12000 r/min遠(yuǎn)心分離15 minで沈殿を収集した、上清を丁寧に注ぎ、70%エタノールで2回洗浄し、風(fēng)乾する。50μLの脫イオン水を取って溶解沈殿した。

2.2.2蛍光PCR検査システムの構(gòu)築

2.2.2.1アヒル毛、ガチョウ毛の特異的蛍光プライマーの設(shè)計(jì)

アヒル、アヒル、マガモ、マガモ、ガチョウ、ガン、鶏、ドバト、ウズラ、北米七面鳥のミトコンドリア12 SrDNA全遺伝子配列に基づいてプライマーとプローブを設(shè)計(jì)し、プライマーとプローブの特異性を考慮した上で、プライマーとプローブの結(jié)合部位で、アヒルとその祖先種の緑頭アヒルとマガモの配列が一致し、ガチョウとその祖先種のガンの配列が一致することを保証した。

　　2.2.2.2蛍光PCR増幅及び結(jié)果判斷

反応系（20μL）：2×premix Ex Taq 10μL、上下流プライマー各0.2μmol/L、プローブ0.1μmol/L、テンプレートDNA 4μL。反応手順：95℃30 s、95℃5 s、60℃34 s、40サイクル。結(jié)果判斷：Ct値≦35の場合、結(jié)果は陽性と判定でき、Ct値>35の場合、結(jié)果は陰性と判定することができる。

2.2.2.3方法の特異性と検出限界試験

抽出したアヒル、アヒル、アヒルの綿毛、ガチョウ、ガチョウの綿毛、鶏、ウズラ、家牛、水牛、豚、羊、ヤギ、馬、ウサギ、マウス、サケ精DNAを増幅テンプレートとし、アヒルの綿毛、ガチョウの綿毛の特異的プライマーとプローブを用いて蛍光PCR反応を行い、方法の特異性を検証する。そして、100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pgのテンプレートで蛍光PCR反応を行い、方法の検出限界を測定し、勾配ごとに3つの平行を作る。

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2.2.3サンプル検査

18個(gè)のアヒル毛製品を選択し、1.2.1の手順でDNAを抽出し、2.2.2に従って蛍光PCR反応を行い、使用したサンプルを表2に示した。ビロード製品は比較的に少ないため、市場ではビロード製品は購入できず、サンプル試験にはビロード製品は含まれていない。

　　3結(jié)果

3.1アヒル毛及びガチョウ毛製品のDNA抽出方法の確立アヒル毛及びガチョウ毛製品が肉眼で明らかな毛嚢を含むため、試験中にアヒル毛及びガチョウ毛嚢の部位を切り取り、SDS-イソチオシアネート-β-疎基エタノール法を用いてアヒル毛及びガチョウ毛DNAを抽出する。抽出されたDNA濃度は20 ng?200 ngに達(dá)し、蛍光PCR反応を行った時(shí)のアヒル毛DNA及びガチョウ毛DNAのCt値はそれぞれ25と26であり（図1）、この方法を用いて抽出されたDNA品質(zhì)は蛍光PCRの要求を満たすことを表明した。

3.2方法特異性試験結(jié)果

その結(jié)果、アヒルの毛の特異性蛍光プライマーはアヒル、アヒルの毛、アヒルの毛のDNAを増幅することができ、他の種のDNAと非特異的に増幅することができ、ガチョウ毛の特異的蛍光プライマーはガチョウとガチョウ毛のDNAを増幅するだけで、他の種のDNAと非特異的に増幅することができ、設(shè)計(jì)されたプライマーの特異性が良いことを示している。

3.3方法検出限界試験結(jié)果

結(jié)果、本方法を用いて100%アヒル絨毯原料及び100%ガチョウ絨毯原料DNAを抽出して蛍光PCR反応を行った場合、DNA検出限界は10 ng（サケ精DNAを含む）であった。

3.4サンプル検査試験結(jié)果

検査結(jié)果により、18個(gè)のアヒル毛サンプルはすべてアヒルDNA成分を検出でき、ガチョウDNA成分は検出されず、検査結(jié)果は製品の明示成分と一致した（表1）。単獨(dú)でアヒルの特異性プライマーとアヒルの特異性プライマーを用いて蛍光PCR反応を行い、18個(gè)のサンプルはすべてアヒルのDNA成分を検出し、アヒルのDNA成分を検出しなかった、18個(gè)のアヒルの絨毯製品はすべてアヒルの絨毯から來たことを表明した。

　4ディスカッション

動(dòng)物繊維中のDNAは主に毛嚢部位に存在し、毛幹中にも少量のミトコンドリアDNAが存在している[8]。羽毛製品は肉眼で見える毛嚢を含んでいるため、試験過程で毛嚢部位を重點(diǎn)的に採取し、SDS-イソチオ水素酸グアニジン-β-メルカプトエタノールDNA抽出法[7]を用いてDNA抽出を行った場合、羽毛毛嚢部位は基本的に溶解し、毛幹は広範(fàn)囲に破斷し、サンプル検査試験を通じて、この方法はアヒルの綿毛とガチョウの綿毛のDNAを抽出することに成功することを表明した。

本試験はミトコンドリア16 S rDNA遺伝子配列をプライマー設(shè)計(jì)標(biāo)的部位として選択し、プライマー設(shè)計(jì)時(shí)に、設(shè)計(jì)されたプライマーが全世界の異なるアヒルガチョウ品種系をカバーできることを考慮しなければならない。理論的には、アヒル、ガチョウとその祖先種の分化時(shí)間はアヒル、ガチョウの各品種の分化時(shí)間より長いため、あるDNA配列がガチョウとその祖先種の中で保守的であれば、すべての馴化品系の中で保守的であることを保証することができ、それによって理論的にこのプライマーがすべてのガチョウ品種の羽毛製品を検査することができることを保証する。ウィキペディアや関連文獻(xiàn)の記事[9-10]によると、イボ鼻棲鴨（Cairina moscata、通稱マガモ）のほか、カモはハガモ屬の中のアオガモ（Anas Platyrhynchos）とマダラノハシガモ（A.poecilorhyncha）が起源で、マガモは中南米から導(dǎo)入されたアヒル種である。ガチョウは雁類の野鳥が人間の長期的な馴化によって形成され、その中で中國

ガチョウは鴻雁（Anser cygnoides）によって飼いならされ、ヨーロッパのガチョウは灰雁（A.anser）によって飼いならされた。そのため、アヒル、アヒル、ガチョウとその祖先種をダウンロードし、同時(shí)に類似品種をダウンロードしてプライマー設(shè)計(jì)を行い、設(shè)計(jì)したプライマーはNCBIデータベースBLAST照合及び特異性試験を通じて、特異性が良いことを表明した。

羽毛繊維の種類の鑑定は現(xiàn)在、主に顕微鏡法に頼っており、この方法は操作が簡単であるが、試験者の素質(zhì)と経験に頼りすぎて、主観性が強(qiáng)すぎて、本研究開発の方法は伝統(tǒng)的な顕微鏡鑑定方法の有力な補(bǔ)助として、羽毛鑑定の客観性と正確性をさらに高めることができる。